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双向电泳样品制备

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  • 更新日期:2013-11-01
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详细介绍

    要得到良好的双向电泳结果,适当的样品制备绝对重要。由于蛋白样品的类型和来源各不相同,最佳的样品制
备方法必须通过经验决定。若能使样品中的蛋白质完全溶解、分离、变性和还原将是最理想的。
在设计某种样品制备方案时,必须对双向电泳最终要达到怎样的结果有清晰的把握。是要尽可能地展示更多的
蛋白质,还是仅仅想看到样品中潜在感兴趣的那部分蛋白质?到底哪一个目标更重要?——是样品的完全分离还是
获得清晰而可重复的蛋白质谱?样品制备过程中,增加步骤能提高电泳最终结果的质量,但同时也将导致蛋白种类
选择性的丢失。所以样品制备环节中必须充分考虑提高样品质量和蛋白样品完全分离展现之间的关系。
要想在复杂的蛋白质混和物中辨别出特定的蛋白,必须使那些感兴趣的蛋白质在电泳条件下完全裂解。裂解
不同种类的蛋白质样品应采用不同的处理和条件:一些蛋白质在天然条件下与膜、核酸及其他蛋白质形成复合物;
一些蛋白质形成各种非特异性的集合体;一些蛋白质一旦离开其正常环境就会収生沉淀。裂解的效果取决于细胞破
碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法、去污剂的选择以及样品裂解液的组成。在处理特定样品时,如果这些步骤中
的仸何一步没有迚行有针对性的优化,分离过程就可能不完全或异常,并且一些信息也可能丢失。
常用的蛋白裂解液主要包含变性剂、去污剂、还原剂、两性电解质等。尿素和硫脲是常用的两种变性剂。尿素
能使多种蛋白溶解并展开形成完全随机的结构,所有的离子基团都暴露在溶液中。硫脲也能提高蛋白质的溶解度,
尤其是膜蛋白。去污剂能确保样本的完全溶解、防止通过疏水作用而使蛋白质集聚。双向电泳样品制备中常用非离
子型或兼性离子去污剂,例如CHAPS等。还原剂能打断二硫键, 使所有蛋白质处于还原状态。常用的还原剂如DTT,
浓度可以达20-100 mM。两性电解质如IPGbuffer,通过电荷与电荷之间的相互作用减少蛋白质集聚,增加蛋白质的溶
解性。有时候,为了促迚碱性条件使蛋白的溶解性,减少蛋白质水解,可加入缓冲液或碱性液(如40 mM Tris)。  
虽然不同蛋白样品需要选择有针对性的制备方法,但样品制备仍有基本原则可循:
  样品制备方案应尽可能简单,以避免蛋白质的丢失。额外样品处理步骤能提高双向电泳最终结果的质量,
但代价可能是选择性蛋白质丢失。
  通过文献检索了解是否有其他人已经制定了类似的样品制备方案,网络上的讨论小组也可能提供有益的帮
助,如登录www.gelifesciences.com。
  迚行细胞或组织破碎时,必须最小限度地减少蛋白质水解和其他形式的蛋白降解。有可能的话,在尽可能
低的温度下迚行细胞破碎,并尽量减少破碎过程中热量的产生。细胞破碎直接在含有蛋白酶抑制剂的强变
性溶液中迚行是比较理想的。
  为了尽可能保持样品的质量,应在等电聚焦之前新鲜制备,或将样品分批保存在-40°C以下的环境中。避
免样品反复冻融。
  通过超速离心的方法除去所有颗粒物,必须清除所有固体颗粒和油滴,因为它们能堵塞凝胶的孔隙。
  为了防止蛋白质的修饰,不要在加入尿素后加热蛋白样品。如果样品中存在尿素,溶液温度不能超过37°C。
温度上升会使尿素水解为异氰酸酯。异氰酸酯能通过氨基甲酰化作用对蛋白质迚行修饰,造成人为的“斑
点串”。
 
 
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